妊娠期間胎盤可釋放外泌體到全身循環(huán)系統(tǒng)，參與妊娠期間母胎界面的免疫調(diào)節(jié),、子宮螺旋動脈重塑和胎盤屏障的形成等重要事件調(diào)控,，在正常妊娠過程維持中發(fā)揮重要作用。而很多妊娠并發(fā)癥，如子癇前期等胎盤功能紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生,，很可能與胎盤來源外泌體異常密切相關(guān),。目前外泌體分離方法主要包括：多步差速離心、蔗糖密度梯度離心,、試劑盒沉淀,、免疫磁珠分選、色譜法,、過濾離心等方法,。其中，多步差速離心是制備外泌體的經(jīng)典方法,，該方法是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)差速離心將其分離出來,，然而妊娠期母血清中除含有胎盤組織釋放的外泌體，還包括許多其他種類細胞釋放的外泌體,，如樹突狀細胞,、淋巴細胞等，且血清中可能還存在一些大小類似的物質(zhì)混雜其中,，這些因素都會影響胎盤來源外泌體的分離純化,。有報導指出，外泌體內(nèi)miRNA參與促進血管新生,、抗癥性和促進膠原蛋白沉淀等一系列過程,。腹水提取試劑盒公司

外泌體生物學功能：1、在心血管系統(tǒng)中,，據(jù)報道，源自人胚胎干細胞（ESC）的間充質(zhì)干細胞（MSC）外泌體可減少小鼠和豬模型中的心肌缺血和再灌注損傷,；2,、在免疫系統(tǒng)中，據(jù)報道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細胞之間轉(zhuǎn)移是細胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機制,；3,、在中樞的神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體的作用是消除廢物并介導大腦活動,，從而阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理,；迄今為止，尚未完全發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)外泌體-細胞結(jié)合的途徑,。然而,，比較明顯，其結(jié)合過程從外泌體識別受體細胞PM上的特定受體開始,。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎,，它可能活躍受體并隨后導致相關(guān)信號通路的活躍，外泌體與PM融合或外泌體的內(nèi)吞作用，從而導致蛋白質(zhì)和RNA直接釋放到受體細胞中,。腦脊液提取試劑盒公司超速離心法,，這是目前外泌體提取較常用的方法。

外泌體的提取分離方法：1,、PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān),。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性）,，顆粒大小不均一,，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等,，因此發(fā)表文章時易受質(zhì)疑,。2、試劑盒提?。航鼛啄陙?，市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分,，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化,，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。

外泌體的提取分離方法：1,、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段,，采用低速離心、高速離心交替進行,，可分離到大小相近的囊泡顆粒,。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎,，但過程比較費時,，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑,；此外,，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量,。2,、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層,，是一種區(qū)帶分離法,。通過密度梯度離心,，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高,，但步驟繁瑣,，耗時。不同類別的外泌體囊泡有三個征：表面具涂層的膜泡,、內(nèi)含纖維的膜泡,、電子致密囊泡。

免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一,，其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合,。首先對樣品進行處理將囊泡裂解并將蛋白質(zhì)變性，變性后,，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上并暴露于針對目的抗原的抗體中?？贵w特異性識別膜表面上的抗原,，然后將膜暴露于第二抗體中。通過二抗的熒光標簽或與二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶基團進行檢測,。常用的標記蛋白為CD63,、CD81、TSG101和ALIX等,。但是此方法的特異性和重復性會受到所用抗體質(zhì)量的限制,。建立記錄各論文實驗條件的數(shù)據(jù)庫也可作為規(guī)避混亂的方法之一。外泌體臨床應用

各種細胞粘著分子在外泌體膜表面表達,，由其決定外泌體被運輸往哪一種細胞,。腹水提取試劑盒公司

外泌體的提取、純化和鑒定：每一個外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱,。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,，并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達到分離效果,。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學（電子顯微鏡技術(shù)）、粒子大小以及標志蛋白等方式實現(xiàn)的,。近來的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,，如免疫中抗原呈遞、瘤子的生長與遷移,、組織損傷的修復等,。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物,。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),，能比較好的保護其包被的物質(zhì),，且能靶向特定細胞或組織，因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng),。腹水提取試劑盒公司

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